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Agilent 1100 LC現場(chǎng)培訓教材
  • 發(fā)布日期：2013-06-13      瀏覽次數：2871

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      Agilent 1100 LC現場(chǎng)培訓教材
      一、培訓目的：
      ●       基本了解1100LC硬件操作。
      ●       掌握化學(xué)工作站的開(kāi)機，關(guān)機，參數設定,學(xué)會(huì )數據采集,數據分析的基本操作。
      二、培訓準備：
      1      、儀器設備： Agilent 1100LC
      ● G1310A :（      單元泵）；G1312A（二元泵）；G1311A（四元泵）。
      ● G1313A      （自動(dòng)進(jìn)樣器）。
      ● G1316A      （柱溫箱）。
      ● G1314A      （VWD檢測器）。
      ● G1362A      （示差檢測器）。
      ● G131/B （DAD      檢測器）。
      ● G1321A （FLD      檢測器）。
      ●       色譜柱: Zorbax eclipse XDB C8,150mm×4.6mm i.d。
      2、溶劑準備：
      ●       色譜級純或優(yōu)級純乙腈（ACN）或甲醇。
      ●       二次蒸餾水
      基本操作步驟:
      （      一）、開(kāi)機：
      1      、打開(kāi)計算機,進(jìn)入Windows NT （或Windows 2000）畫(huà)面,并運行Bootp Server程序。
      2      、打開(kāi) 1100 LC 各模塊電源。
      3      、待各模塊自檢完成后，雙擊Instrument 1 Online圖標，化學(xué)工作站自動(dòng)與1100LC通訊，進(jìn)入的工作站畫(huà)面如下所示。

      4      、從“View”菜單中選擇“Method and Run control”畫(huà)面, 單擊”View”菜單中的“Show Top Toolbar”，“Show status toolbar”，“System diagram”,”Sampling diagram”，使其命令前有“√”標志，來(lái)調用所需的界面。
      5      、把流動(dòng)相放入溶劑瓶中。
      6      、打開(kāi)Purge閥。
      7      、單擊Pump圖標，出現參數設定菜單，單擊Setup pump選項，進(jìn)入泵編輯畫(huà)面。
      8       、設Flow：5ml/min，單擊OK。
      9      、單擊Pump圖標，出現參數設定菜單，單擊Pump control選項，選中On，單擊OK，則系統開(kāi)始Purge，直到管線(xiàn)內（由溶劑瓶到泵入口）無(wú)氣泡為止,切換通道繼續Purge，直到所有要用通道無(wú)氣泡為止。
      10      、單擊Pump圖標，出現參數設定菜單，單擊Pump Control選項，選中Off，單擊Ok關(guān)泵，關(guān)閉 Purge valve。
      11      、單擊Pump圖標，出現參數設定菜單，單擊Setup pump選項，進(jìn)入Pump編輯畫(huà)面，設Flow：1.0ml/min。
      12      、單擊泵下面的瓶圖標，如圖所示（以二元泵為例），輸入溶劑的實(shí)際體積和瓶體積。也可輸入停泵的體積。單擊Ok。
      （二）數據采集方法編輯：
      1      、開(kāi)始編輯完整方法：

      ●       從“Method”菜單中選擇“Edit entire method” 項，如上圖所示選中除“Data analysis ”外的三項，單擊Ok，進(jìn)入下一畫(huà)面。
      2、方法信息：
      ●       在“Method Comments”中加入方法的信息（如：方法的用途等）。

      ●       單擊Ok 進(jìn)入下一畫(huà)面。
      3、泵參數設定：（以二元泵為例）
      ●       在“Flow”處輸入流量,如1ml/min，在“Solvent B”處輸入70.0,（A=100-B） ,也可Insert 一行”Timetable” ,編輯梯度。在“Pressure Limits Max”處輸入柱子的zui大耐高壓，以保護柱子。

      ●       單擊Ok進(jìn)入下一畫(huà)面。
      4、自動(dòng)進(jìn)樣器參數設定:
      ●       選擇合適的進(jìn)樣方式, 如圖所示，進(jìn)樣體積 1.0ul ,洗瓶位置為6號。“Standard Injection”----只能輸入進(jìn)樣體積，此方式無(wú)洗針功能。“Injection with Needle Wash”----可以輸入進(jìn)樣體積和洗瓶位置，此方式針從樣品瓶抽完樣品后，會(huì )在洗瓶中洗針。“Use injector program”---可以點(diǎn)擊Edit 鍵進(jìn)行進(jìn)樣程序編輯。
      ● 點(diǎn)擊Ok進(jìn)入下一畫(huà)面。
      5、柱溫箱參數設定:
      ●       在”Temperature”下面的方框內輸入所需溫度,并選中它,點(diǎn)擊”more>>” 鍵,如圖所示,選中”Same as left”---使柱溫箱的溫度左右一致。

      ●       點(diǎn)擊ok進(jìn)入下一畫(huà)面。
      6、VWD檢測器參數設定:
      ●       在”Wavelength”下方的空白處輸入所需的檢測波長(cháng),如254nm, 在”Peak width （Response time）”下方點(diǎn)擊下拉式三角框,選擇合適的響應時(shí)間, 如>0.1min （2s）。

      ●       在Timetable 中可以“Insert”一行，輸入隨時(shí)間切換的波長(cháng)，如1min ，波長(cháng)=300nm。點(diǎn)擊ok進(jìn)入下一畫(huà)面。
      7、DAD檢測器參數設定:
      ●       檢測波長(cháng): 254nm,BW=30nm, 參比波長(cháng)=350nm,BW=100nm;
      ●       檢測波長(cháng)：一般選擇zui大吸收處的波長(cháng)。樣品帶寬BW：一般選擇zui大吸收值一半處的整個(gè)寬度。參比波長(cháng)：一般選擇在靠近樣品信號的無(wú)吸收或低吸收區域。參比帶寬BW：至少要與樣品信號的帶寬相等，許多情況下用100nm作為缺省值。Peak width（Response time）：其值盡可能接近要測的窄峰峰寬。Slit—狹縫窄，光譜分辨率高；寬時(shí)，噪音低。同時(shí)可以輸入采集光譜方式，步長(cháng)，范圍，閾值。選中所用的燈。

      ●       點(diǎn)擊Ok進(jìn)入下一畫(huà)面。
      8、 RID檢測器參數設定:
      ●       色譜條件:
      進(jìn)樣體積: 20ul。     光學(xué)單元溫度: Off 。
      極性: 正。           峰寬（響應時(shí)間） : 4s 。
      ●       如圖所示: “Optical Unit Temperature”---若環(huán)境溫度控制在±2℃,設定為Off, 若環(huán)境溫度不穩定,則設定光學(xué)單元溫度為高于環(huán)境溫度5度,以防樣品在池中沉淀。“Peak width”---大多數分析設為4S，只有在高速分析下設為更短。“Automatic recycling after analysis”---在不進(jìn)行分析時(shí)可以讓流動(dòng)相循環(huán)，節省流動(dòng)相，檢測器連續運行，可隨時(shí)投入使用。

      ● *****       點(diǎn)擊RID圖標，選擇RID Control ：Heater 設為On，若要循環(huán)流動(dòng)相，必須將“Recycling Valve”設為ON。手動(dòng)purge 參比池，將其設為On，并輸入Purge 時(shí)間。
      9、 FLD檢測器參數設定:
      色譜條件：
      ●       樣品：P/N 01018-68704 用甲醇稀釋為1:10。
      ●       進(jìn)樣體積：5ul。
      ●       柱溫箱: 30℃。 EX=246nm, EM=317nm ,PMT=10。
      ●       響應時(shí)間=4s. 停止時(shí)間：出峰完畢。
      ● Excitation A:       激發(fā)波長(cháng):200-700nm,步長(cháng)為1nm,或Zero Order。
      ● Emission:       發(fā)射波長(cháng): 280-900nm, 步長(cháng)為1nm,或Zero Order。
      ● PMT:       大多數應用適當的設定值為10,若高濃度樣品峰被切平頭,則減少 PMT 值。
      ● “Peak width”      ：大多數應用設為4s，只有快速分析采用小的設定值。
      ● Multi Ex       ：多波長(cháng)及光譜（激發(fā)）。
      ● Multi Em      ：多波長(cháng)及光譜（發(fā)射）。
      ●       同時(shí)可以輸入范圍Range、步長(cháng)step、采集光譜。
      10、在“ Run time checklist ”中選中“Data acquisition”，單擊Ok。
      11、單擊“Method”菜單，選中“Save method as”，輸入一方法名，如“test”，單擊Ok。
      12、從菜單 “View”中選中”Online signal” ,選中Windows 1,然后單擊Change 鈕,將所要繪圖的信號移到右邊的框中,點(diǎn)擊Ok.（如同時(shí)檢測二個(gè)信號,則重復12,選中 Windows 2）。
      13、從“Run control ”菜單中選擇“Sample info”選項，如上圖所示，輸入操作者名稱(chēng)，在“Data file ”中選擇“Manual”或“Prefix”。

      區別: Manual--每次做樣之前必須給出新名字,否則儀器會(huì )將上次的數據覆蓋掉。 Prefix—在Prefix 框中輸入前綴，在Counter 框中輸入計數器的起始位，儀器會(huì )自動(dòng)命名，如vwd0001，vwd0002……。
      14、從Instrument 菜單選擇System on。
      15、等儀器Ready，基線(xiàn)平穩，從Method菜單中選擇“Run method”，進(jìn)樣。（DAD, VWD色譜圖如下所示：）
      （三）、數據分析方法編輯:
      1      、從“View”菜單中，單擊“Data analysis”進(jìn)入數據分析畫(huà)面。
      2      、從“File”菜單選擇“Load signal”，選中您的數據文件名，如下圖所示。單擊Ok。
      3      、做譜圖優(yōu)化,從“Graphics”菜單中選擇“Signal options”選項，。從Ranges中選擇Auto scale及合適的顯示時(shí)間，單擊ok,或選擇”Use Ranges” 調整。反復進(jìn)行，直到圖的比例合適為止。

      4      、積分:
      （1）      、從“Integration”中選擇 “Auto integrate”,如積分結果不理想,再從菜單中選擇“Integration Events”選項，選擇合適的Slope sensitivity，Peak width，Area reject，Height reject。
      （2）      、從“Integration”菜單中選擇“Integrate”選項，則數據被積分。
      （3）      、如積分結果不理想，則修改相應的積分參數，直到滿(mǎn)意為止。

      （4）      、單擊左邊“√”圖標，將積分參數存入方法。
      5、打印報告:
      （1）      、從“Report”菜單中選擇“Specify report”選項，進(jìn)入如上畫(huà)面。
      （2）      、單擊“Quantitative Results”框中Calculate右側的黑三角，選中Percent（面積百分比），其它選項不變。
      （3）      、單擊Ok.
      （4）      、從“Report”菜單中選擇“Print report”，則報告結果將打印到屏幕上，如想輸出到打印機上，則單擊Report 底部的“Print”鈕。
      （四）、關(guān)機:
      ●       關(guān)機前，用 100%的水沖洗系統20分鐘，然后用有機溶劑沖洗系統10分鐘（如ACN），然后關(guān)泵，（適于反相色譜柱）。[正相色譜柱用適當的溶劑沖洗]
      ●       退出化學(xué)工作站，及其它窗口，關(guān)閉計算機（用shut down關(guān)）。
      ●       關(guān)掉Agilent 1100電源開(kāi)關(guān)。
      （五）、Agilent 1100 LC維護保養：
      1      、色譜柱長(cháng)時(shí)間不用，存放時(shí)，柱內應充滿(mǎn)溶劑，兩端封死（如ACN適于反相色譜柱，正相色譜柱用相應的有機相）
      2      、對于手動(dòng)進(jìn)樣器，當使用緩沖溶液時(shí)，要用水沖洗進(jìn)樣口，同時(shí)搬動(dòng)進(jìn)樣閥數次，每次數毫升。
      *3      、流動(dòng)相使用前必須過(guò)濾，不要使用多日存放的蒸餾水（易長(cháng)菌）。
      *4      、帶seal-wash的 1100，要配制90%水+10%異丙醇，以每分2—3滴的速度虹吸排出，溶劑不能干涸。
      5      、其它主意事項見(jiàn)說(shuō)明書(shū)，或由現場(chǎng)工程師介紹。
      維護知識問(wèn)答
      1      、為什么溶劑和樣品要過(guò)濾?
      溶劑和樣品過(guò)濾非常重要，它會(huì )對色譜柱、儀器起到保護作用，消除由于污染對分析結果的影響。
      色譜柱：由于填料顆粒很細，色譜柱內腔很小，溶劑和樣品中的細小顆粒會(huì )使色譜柱和毛細管容易堵塞。
      儀器：溶劑和樣品中的細小顆粒會(huì )增加進(jìn)樣閥的堵塞和磨損，同時(shí)也會(huì )增加泵頭內的藍寶石活塞桿和活塞的磨損。
      樣品過(guò)濾頭的類(lèi)型：
      30mm      內徑：適用于大進(jìn)樣量的過(guò)濾，由0.2μm和0.45μm兩種規格,材料有纖維素,醋酸纖維,聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50μl。
      13mm      內徑：適用于范圍廣的過(guò)濾，由0.2μm和0.45μm兩種規格,材料為纖維素。
      3mm      內徑：適用于小進(jìn)樣量的過(guò)濾，由0.2μm和0.45μm兩種規格。處理樣品體積為7μl。
      濾膜類(lèi)型：
      聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無(wú)任何可溶物。
      醋酸纖維濾膜：不適用于有機溶劑，特別適用于水基溶液，推薦用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)樣品。
      尼龍66濾膜：適用于絕大多數有機溶劑和水溶液，可用于強酸，70%乙醇、二氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。
      再生纖維素濾膜：具有蛋白吸收低，同樣適用水溶性樣品和有機溶劑。
      2、為什么HPLC用緩沖鹽時(shí)要加在線(xiàn)Seal-wash選項？
      HPLC      用緩沖鹽時(shí),由于泵頭內的緩沖鹽溶液存在高壓析鹽現象,析出的細小鹽粒非常堅硬,它附著(zhù)在藍寶石活塞桿上,隨著(zhù)藍寶石活塞桿的往復運動(dòng),容易產(chǎn)生劃痕,并磨損密封墊,造成漏液等故障現象。在線(xiàn)Seal-wash選項能有效的帶走可能存在的緩沖鹽結晶。緩沖鹽的濃度在0.1mol或大于0.1mol時(shí),必須使用該在線(xiàn)沖洗選項. 清洗液配制: 90%水+10%異丙醇.該混合液可抑制菌類(lèi)生長(cháng)和減小水的表面張力。以2-3滴/min的速度虹吸流下，不能干涸。
      3、為什么Agilent 1100LC的流動(dòng)相管路非常細?
      在使用HPLC時(shí),應特別注意”柱外效應”對分析結果的影響，由于樣品分子在液體流動(dòng)相中的擴散系數比在氣體中小4~5個(gè)數量級，液體流動(dòng)相的流速也比氣相慢1-2個(gè)數量級。因此，樣品進(jìn)入色譜柱后，在柱子以外的任何死體積（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管、檢測器）中，樣品分子的擴散和滯留，都會(huì )引起色譜峰的展寬，而使柱效降低。為使柱外效應減之zui小，獲得理想的分析結果，Agilent 1100LC 使用加工工藝難度高的毛細管線(xiàn)作為流動(dòng)相管路。
      毛細管線(xiàn)分類(lèi)：0.17mm內徑 ------綠色 ;0.12mm內徑-------紅色。
      PEEK       管線(xiàn)：內徑 -----0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm。
      毛細管線(xiàn)優(yōu)點(diǎn): 柔韌性好.
      ***Agilent       公司同時(shí)備有1/16in 的粗外徑毛細管線(xiàn),適用于不同習慣的用戶(hù) ,優(yōu)點(diǎn)是剛性好,但柔韌性差一些。
      4、流動(dòng)相使用前為什么要脫氣？
      流動(dòng)相使用前必須進(jìn)行脫氣處理，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過(guò)程中當流動(dòng)相由色譜柱流至檢測器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì )增加基線(xiàn)的噪音，造成靈敏度下降，甚至無(wú)法分析。溶解的氧氣還會(huì )導致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用FLD，可能會(huì )造成熒光猝滅。
      常用的脫氣方法比較：
      氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續吹氦脫氣，效果較好，但成本高。
      加熱回流法：效果較好，但操作復雜，且有毒性揮發(fā)污染。
      抽真空脫氣法：易抽走有機相。
      超聲脫氣法：流動(dòng)相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10-15min，此法效果zui差。
      在線(xiàn)真空脫氣法：Agilent1100LC真空脫機利用膜滲透技術(shù)，在線(xiàn)脫氣，智能控制，無(wú)需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。
      5、如何防止溶劑瓶?jì)热軇┻^(guò)濾器的堵塞，以及堵塞后的處理？
      溶劑的質(zhì)量或污染以及藻類(lèi)的生長(cháng)會(huì )堵塞溶劑過(guò)濾器，從而影響泵的運行，尤其水溶液或磷酸鹽緩沖液（PH=4—7）。以下幾種方法可以有效防止溶劑瓶?jì)热軇┻^(guò)濾器的堵塞。
      A      ：請嚴格執行溶劑過(guò)濾。
      B      ：請勿使用多日存放的蒸餾水及磷酸鹽緩沖液
      C      ：如果應用許可，可在溶劑中加入0.0001---0.001M的*.
      D:      在溶劑瓶?jì)热軇┑纳戏叫×髁窟B續吹氬氣,以隔絕空氣。
      E      ：避免使溶劑瓶暴露在直射陽(yáng)光下，盡量使用琥珀色的溶劑瓶盛放水溶液或磷酸鹽緩沖液。
      堵塞后的處理法方法：
      將過(guò)濾頭從組件中取下，在濃硝酸（35%）中浸泡1h，然后用二次蒸餾水沖洗干凈并超聲處理。
      6、 Agilent 1100LC泵如何維護？
      Agilent 1100LC      泵給色譜柱提供穩定、無(wú)脈動(dòng)、流量準確的流動(dòng)相，及時(shí)合理的維護非常重要。
      A      ：流動(dòng)相使用前請必須脫氣、過(guò)濾。
      B      ：使用緩沖鹽時(shí)，要加在線(xiàn)Seal-wash選項。
      C      ：關(guān)機前，用 100%的水沖洗系統20分鐘，然后用有機溶劑沖洗系統10分鐘（如甲醇），然后關(guān)泵，（適于反相色譜柱）。[正相色譜柱用適當的溶劑沖洗]
      D      ：及時(shí)更換Purge Valve內的過(guò)濾芯。（當打開(kāi)Purge Valve時(shí)，壓力高于10bar，表明過(guò)濾芯已堵）。E：使用合適的密封圈。
      7、如何選擇合適的泵頭活塞密封圈？
      泵頭活塞的標準密封圈能適合于大多數應用，但使用正相溶劑（如正己烷），不適合使用標準活塞密封圈，特別是長(cháng)時(shí)間使用時(shí)，需更換另一種不同的密封圈，我們建議使用聚四氟乙烯密封圈。（p/n0905-1420 2/pk）
      ***      注意：聚四氟乙烯密封圈的壓力范圍為：0—200bar；建議在泵的壓力限制中，將zui大壓力設為200bar。
      8、使用梯度比例發(fā)時(shí)要注意那些事項？
      當鹽溶液與有機溶劑溶液混合時(shí)，鹽溶液能與有機溶劑溶液*混溶，而不會(huì )出現沉淀。但是在比例閥的混合點(diǎn)，重力作用使鹽顆粒沉淀下來(lái)，通常，閥A接水相/鹽溶液，D接有機溶劑，此法連接可有效使鹽回落到鹽溶液中，并被溶解。若顛倒過(guò)來(lái)，鹽可能落在有機溶劑中，出現問(wèn)題。強烈建議：當使用緩沖鹽溶液和有機溶劑時(shí)，推薦將緩沖鹽通道接在A通道上，有機溶劑通道直接接在A通道的上方D通道上；定期用水沖洗所有的通道，以除去閥口上可能出現的鹽沉淀。
      9、在線(xiàn)真空脫氣機使用要注意那些事項？
      一般來(lái)說(shuō)，Agilent 1100LC 的真空脫氣機無(wú)需過(guò)多維護，只需注意幾個(gè)注意事項就可以了。
      A      ：*次使用，要用隨儀器附帶的注射器抽滿(mǎn)脫氣機腔體；更換不同類(lèi)型的溶劑時(shí)，要先抽空，再抽滿(mǎn)。 B：不用的通道要充滿(mǎn)溶劑或密閉起來(lái)。
      10、更換色譜柱時(shí)要注意什么事項?
      在使用HPLC時(shí),應特別注意”柱外效應”對分析結果的影響，由于樣品分子在液體流動(dòng)相中的擴散系數比在氣體中小4~5個(gè)數量級，液體流動(dòng)相的流速也比氣相慢1-2個(gè)數量級。因此，樣品進(jìn)入色譜柱后，在柱子以外的任何死體積（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管、檢測器）中，樣品分子的擴散和滯留，都會(huì )引起色譜峰的展寬，而使柱效降低。為使柱外效應減之zui小，獲得理想的分析結果，儀器的流動(dòng)相管路連接非常重要,一般Agilent 1100LC 在*次安裝時(shí),均有受過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓的安裝工程師負責安裝,各種接頭會(huì )處理的非常?？蛻?hù)只需在更換色譜柱時(shí)注意接頭處理就可以了，一般柱子入口接頭為不銹鋼卡套接頭，柱子出口為不銹鋼卡套接頭或PEEK管線(xiàn)手擰街頭，當完成*次安張后，不銹鋼卡套已固定死，當接不同的柱子時(shí)，要注意柱子接頭處的形狀和長(cháng)度，否則會(huì )產(chǎn)生一個(gè)非常大的死體積。
      下面是不同廠(chǎng)家柱子接頭的形狀和長(cháng)度，請參考：

      11      、手動(dòng)進(jìn)樣閥需做那些維護，使用時(shí)要注意什么？
      對于手動(dòng)進(jìn)樣器，當使用緩沖溶液后，或者進(jìn)濃度差異比較大的樣品時(shí)要用工具而不是用帶針頭的注射器沖洗進(jìn)樣口，同時(shí)搬動(dòng)進(jìn)樣閥數次，每次數毫升。
      注意事項：
      ●       安裝時(shí)六通閥的5，6出口要與注射器在同一水平線(xiàn)上，以防止虹吸現象的發(fā)生，導致進(jìn)樣量的重復性變異。
      ●       進(jìn)樣量的多少要根據定量管的LOOP體積決定。
      當樣品量少時(shí)：進(jìn)樣體積由注射器的進(jìn)樣體積決定，但zui大進(jìn)樣體積要小于1/2loop體積。
      當樣品量較多時(shí)：進(jìn)樣體積由定量管的體積決定，為保證樣品*把定量管的流動(dòng)相置換干凈，需注射5—6倍的LOOP體積。
      ● C      ：要使用的液相注射器進(jìn)樣，不可以用氣相的注射器。
       
       
       
       

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